2011 - Cláudio Roberto Novello
Ph.D. Dissertation
Autor/author: Cláudio Roberto Novello
Programa de Pós-Graduação em Química - Universidade Estadual de Maringá
Área do Conhecimento: Fitoquímica
Data de Defesa: 19 de dezembro de 2011
Orientador: Profa. Dra. Maria Helena Sarragiotto
Co-orientador: Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello
Banca examinadora: Profa. Dra. Maria Helena Sarragiotto
Profa. Dra. Débora Cristina Baldoqui
Profa. Dra. Andrea Diniz
Prof. Dr. Wagner Villegas
Prof. Dr. Fernando Batista da Costa
Título: Estudo fitoquímico e avaliação da atividade citotóxica, antioxidante e adaptógena do lenho de Croton echioides Baill. – Euphorbiaceae
Resumo: Croton echioides Baill. (Euphorbiaceae) é uma planta medicinal encontrada no semi-árido brasileiro, denominada popularmente como velame. Na medicina popular é reconhecida por suas propriedades tônica e afrodisíaca. Os caules tem sido amplamente comercializados em substituição as raízes de Ptychopetalum olacoides Benth. (Olacaceae), a marapuama da Amazônia. As plantas do gênero Croton são ricas em diterpenos, alcaloides e flavonoides, que são princípios ativos com diversas atividades biológicas associadas como antitumoral e antioxidante. Neste estudo utilizou-se o lenho com casca de C. echioides, com o qual foram realizados ensaios físico-químicos de controle de qualidade e a otimização do solvente extrator. Para a escolha do melhor solvente extrator foram determinados o teor de resíduo seco e a capacidade antioxidante dos extratos obtidos com vários solventes de polaridade diversa. A mistura etanol/água a 70% foi o solvente mais eficaz entre os parâmetros testados sendo utilizado para a produção do extrato bruto (EB) pelo processo de Ultra-Turrax. O extrato bruto foi suspenso em água e particionado em cinco frações com n-hexano, diclorometano, acetato de etila e n-butanol. As frações obtidas com n-hexano (FH) e acetato de etila (FA) foram submetidas a sucessivos processos cromatográficos de separação. Foram isolados e identificados por análises espectroscópicas, espectrométricas e comparação com dados da literatura, da fração FH, os diterpenos do tipo clerodano 15,16-epóxi-3,13(16),14-neo-clerodatrien-17,18-dicarboxilato de metila (nasimalun B) (CEH-1), 15,16-epóxi-3,13(16),14-neo-clerodatrien-17-carbóxi-18-carboxilato de metila (CEH-2), 3-oxo-15,16-epóxi-13(16),14-neo-clerodadien-17,18-dicarboxilato de metila (CEH-3), ptychonal-hemiacetal (CEH-4a) e ptychonal (CEH-4b) (em mistura), e éster metílico do ácido hardwickico (CEH-5); o sesquiterpeno trans–1(10)-epóxi-4(15)-cariofileno (CEH-6); o triterpeno lupeol (CEH-7); os fitoesteróides β-sitosterol (CEH-8) e estigmasterol (CEH-9) (em mistura) e β-sitosterol glicosilado (CEH-10). Da fração FA foram isolados e identificados os alcaloides indólicos N-trans-p-coumaroil-triptamina (CEA-1), N-trans-p-coumaroil-5-hidroxitriptamina (CEA-2), N-trans-4-metóxi-cinamoil-5-hidroxitriptamina (CEA-3), N-trans-feruloil-5-hidroxitriptamina (moschamina) (CEA-4) e N-trans-feruloil-3,5-dihidroxindolin-2-ona (CEA-5); os flavonoides 3-O-metilcanferol (CEA-6), 3-O-metilquercetina (CEA-7), 3,7-di-O-metilquercetina (CEA-8) e 3,3’-di-O-metilquercetina (CEA-9) e os derivados de ácido benzóico 4-hidróxi ácido benzóico (CEA-10), 4-hidróxi-3-metóxi ácido benzóico (CEA-11) e 4-hidróxi-3,5-dimetóxi ácido benzóico (CEA-12). As substâncias CEH-2, CEH-3 e CEA-5 são inéditas na literatura enquanto a substância CEA-3 foi isolada pela primeira vez de um produto natural. Foram realizados testes comportamentais com o extrato bruto em camundongos jovens: screening farmacológico, atividade motora, tempo de sono induzido por hexabarbital, coordenação motora e labirinto em cruz elevado. No screening farmacológico o extrato mostrou efeito estimulante em baixas doses tanto por administração via oral quanto intraperitoneal e toxicidade evidente nas maiores doses por via intraperitoneal. Os resultados da avaliação da atividade motora não confirmaram a ação estimulante encontrada no screening e indicou efeito depressor na dose 50 mg/Kg. Não foram encontradas diferenças significativas nos parâmetros avaliados no teste de coordenação motora e tempo de sono induzido pelo hexabarbital, mas apenas indícios de efeito depressor na dose de 50 mg/kg neste último. O teste do labirinto em cruz elevada mostrou resultados contraditórios sem prevalência de efeito depressor ou estimulante. Foi determinada a capacidade antioxidante do extrato bruto, das frações obtidas da partição líquido/líquido e dos compostos isolados da fração FA. O valor IC50 para o EB foi de 167,6 mg/mL e 48,9 mg/mL para a FA, a fração mais ativa. Os compostos mais ativos foram CEA-2 (IC50 de 10,7±0,4 mmo/L), CEA-3 (IC50 de 17,5±0,4 mmol/L), CEA-4 (IC50 de 14,5±0,4 mmol/L), CEA-7 (IC50 de 9,2±0,3 mmol/L), CEA-8 (IC50 de 11,0±0,6mmol/L) e CEA-12 (IC50 de 20,2±0,7 mmol/L). Os alcaloides indólicos isolados da fração FA foram testados frente a linhagem de células tumorais de cólon humanas HCT-116 pelo ensaio da sulforhodamina, destacando-se o N-trans-4-metóxicinamoil-5-hidroxitriptamina com IC50 de 29,3 mg/mL e morte de 90% das células tumorais na concentração de 72 mg/mL.
Palavras-chave: Croton echioides, marapuama, diterpenos clerodanos, alcaloides, flavonoides.
Title: Phytochemical study and evaluation of cytotoxic, antioxidant and adaptogenic activity of Croton echioides Baill. - Euphorbiaceae
Abstract: Croton echioides Baill. (Euphorbiaceae) is a medicinal plant found in semi-arid brazilian areas, known popularly as “velame”. In folk medicine it is renowned for its tonic and aphrodisiac properties. Its stem bark has been widely sold as an aphrodisiac and tonic, as a substitute for the roots of Ptychopetalum olacoides Benth. (Olacaceae), the Amazon Marapuama. Plants of the Croton genus are rich in diterpenes, alkaloids and flavonoids, which are active principles associated with many biological activities such as antitumor and antioxidant. In this study stem bark of C. echioides was used to perform quality control physico-chemical tests and optimization of the solvent extractor. To choose the best solvent extractor dry residue content and antioxidant capacity of extracts obtained were determined with several solvents of different polarity. The mixture of ethanol/water at 70% was the most effective solvent in the parameters tested being used for the production of crude extract (EB) through Ultra-Turrax process. The crude extract was suspended in water and partitioned into five fractions with n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate and n-butanol. The fractions obtained with n-hexane (FH) and ethyl acetate (FA) were subjected to successive chromatographic separation processes. Through spectroscopic and spectrometric analysis and comparison with literature data were isolated and identified, from the FH fraction, the diterpenes of the type clerodane 15,16-epoxy-3,13(16),14-neo-clerodatrien-17,18-methyl dicarboxylate (nasimalun B) (CEH-1), 15,16-epoxy-3,13(16),14-neo-clerodatrien-17-carboxy-18-methyl carboxylate (CEH-2), 3-oxo-15,16-epoxy-13(16),14-neo-clerodadien-17,18-methyl dicarboxylate (CEH-3), ptychonal hemiacetal (CEH-4a) and ptychonal (CEH-4b) (in mixture), and hardwickiic acid methyl ester (CEH-5); the sesquiterpene trans-1(10)-epoxy-4(15)-caryophyllene (CEH-6), the triterpene lupeol (CEH-7); the phytosteroids β-sitosterol (CEH-8) and stigmasterol (CEH-9) (in mixture) and β-sitosterol glycoside(CEH-10). From the FA fraction were isolated and identified the indole alkaloids N-trans-p-coumaroyl-tryptamine (CEA-1), N-trans-p-coumaroyl-5-hydroxytryptamine (CEA-2), N-trans-4-methoxy-cinnamoyl-5-hydroxytryptamine (CEA-3), N-trans-feruloyl-5-hydroxytryptamine (moschamine) (CEA-4) and N-trans-feruloyl-3,5-dihydroxyindolin-2-one (CEA-5); the flavonoids 3-O-methyl kaempferol (CEA-6), 3-O-methyl quercetin (CEA-7), 3,7-di-O-methyl quercetin (CEA-8) and 3,3′-di-O-methyl quercetin (CEA-9) and the benzoic acid derivatives 4-hydroxybenzoic acid (CEA-10), 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid (CEA-11) and 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid (CEA-12). The CEH-2, CEH-3 and CEA-5 are new compounds in the literature while CEA-3 was isolated from a natural product for the first time. Behavioral tests were performed with the crude extract in young mice: pharmacological screening, motor activity, hexabarbital-induced sleeping time, motor coordination and elevated plus maze. In pharmacological screening the extract showed stimulating effect at low doses by both intraperitoneal and oral administration and toxicity evident in larger intraperitoneal doses. The motor activity evaluation results have not confirmed the stimulating action found in the screening and indicated a depressing effect at a 50 mg/kg dose. Significant differences were not found in the evaluated parameters in the motor coordination and hexabarbital-induced sleeping time tests, but only signs of depressing effect at a 50 mg/kg dose in this last test. The elevated plus maze test showed contradictory results without the prevalence of depressing or stimulating effect. The antioxidant capacity of the crude extract was determined for the fractions obtained from the liquid/liquid partition and from the FA fraction isolated compounds. The IC50 value for EB was 167.6 mg/mL and 48.9 mg/mL for FA, the most active fraction. The most active compounds were CEA-2 (IC50 of 10.7±0.4 mmol/L), CEA-3 (IC50 of 17.5±0.4 mmol/L), CEA-4 (IC50 of 14.5±0.4 mmol/L), CEA-7 (IC50 of 9.2±0.3 mmol/L), CEA-8 (IC50 of 11.0±0.6 mmol/L) and CEA-12 (IC50 of 20.2±0.7 mmol/L). The indole alkaloids isolated from the FA fraction were tested against a strain of human colon tumor cells HCT-116 by sulforhodamine assay, highlighting the N-trans-4-methoxy-cinnamoyl-5-hydroxytryptamine with IC50 of 29.3 mg/mL and death of 90% of tumor cells at a concentration of 72 mg/mL.
Keywords: Croton echioides, marapuma, clerodane diterpenes, alkaloids, flavonoids.
Tese PDF: Claudio Roberto Novello
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