2011 - Sandra Cristina Girotto Pinto
MSc. Thesis
Autor/author: Sandra Cristina Girotto Pinto
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - Universidade Estadual de Maringá
Área do Conhecimento: Farmacognosia
Data de Defesa: 25 de agosto de 2011
Orientador: Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello
Banca examinadora: Profa. Dra. Elaine Rosely Lepri
Profa. Dra. Maria da Conceição Torrado Truiti
Título: Stryphnodendron adstringens: análise fitoquímica e biológica in vitro e in vivo
Resumo: Os extratos das cascas de Stryphnodendron adstringens possuem excelente atividade cicatrizante já comprovada em animais de laboratório sadios. Isto é um bom indicador de que o extrato desta planta possa ter ação eficaz no tratamento de feridas crônicas em ratos diabéticos. Este trabalho teve por objetivo o isolamento e identificação estrutural de taninos de uma fração semipurificada obtida de Stryphnodendron adstringens utilizando diferentes métodos cromatográficos, avaliar a capacidade antioxidante in vitro do extrato bruto (EB) e semipurificado (frações acetato de etila –FAE e aquosa –FA) pelo método do radical livre DPPH, e avaliar a atividade cicatrizante do extrato bruto em ratos diabéticos. O isolamento das substâncias foi realizado por cromatografia em coluna, cromatografia em contra-corrente de alta velocidade (CCCAV) e cromatografia em camada delgada, e a identificação destas substâncias realizada por meio de métodos 1 13 espectroscópicos de ressonância magnética nuclear (RMN) 1D ( H e C), RMN 2D (COSY 1 1 H- H, HMQC e HMBC), espectrometria de massas e ópticos. A capacidade antioxidante foi determinada pelo método de DPPH, avaliando-se o IC50 (µg/mL). A atividade cicatrizante foi analisada aos 4, 7, 12 e 17 dias de tratamento com gel contendo 1% do EB através do comprimento e espessura da área re-epitelizada, análise de permeação cutânea através de espectroscopia fotoacústica, quantidade de células em metáfases e fibras colágenas (tipo I e III). Foram obtidas 21 subfrações da cromatografia em coluna. As subfrações F4, F5, F6 e F7 foram cromatografadas em CCCAV pra separação das substâncias. Foram identificadas as substâncias 4′-O-metil-galocatequina, galocatequina, epigalocatequina e 4′-O-metil- galocatequina-(4α→8)-4′-O-metil-galocatequina. A capacidade antioxidante das amostras foram: EB=3,99, FAE=3,47, FA=5,19 e vitamina C= 5,19, sendo que o EB e a FAE possuem uma atividade antioxidante cerca de 1,3 e 1,5 vezes maior que a vitamina C, respectivamente. A avaliação da atividade cicatrizante mostrou a formação de uma área re- epitelizada maior no grupo dos animais tratados com EB aos 4 e 7 dias e mais espessa aos 12 e 17 dias, assim como a estimulação da maturação das fibras colágenas (tipo I) aos 17 dias e da proliferação celular das metáfases aos 4 e 7 dias. Na avaliação da atividade cicatrizante, comprovou-se a permeação do EB em todos os tempos analisados e que o gel contendo EB mostrou ação sobre o reparo tecidual, favorecendo uma cicatrização mais rápida e resistente aos 17 dias de tratamento, em relação ao controle. A análise por Western Blotting comprova a maior presença de vasos sanguíneos aos 7 dias pela expressão em grande quantidade de VEGFR.
Palavras-chave: Stryphnodendron adstringens, Cicatrização, Diabetes mellitus, Taninos condensados, Capacidade antioxidante in vitro, VEGFR.
Title: Stryphnodendron adstringens: phytochemistry and biological analysis in vitro and in vivo
Abstract: The extracts from the barks of Stryphnodendron adstringens have excellent wound healing activity demonstrated in healthy laboratory animals. This is a good indicator that the extract of this plant would have effective action in the treatment of chronic wounds in diabetics rats. The aim of this study was the isolation and structural identification of tannins of a semipurified fraction obtained from Stryphnodendron adstringens using different chromatographic methods, evaluation in vitro the antioxidant capacity of crude (CE) and semipurified extracts (Ethyl-acetate –EAF and Aqueous -AF Fractions) by free radical DPPH method, and evaluation the wound healing activity of CE in diabetic rats. The isolation of the compounds was performed by column chromatography, high speed countercurrent chromatography (HSCCC) and TLC. The identification of the compounds carried out by 1 13 1 spectroscopic methods of nuclear magnetic resonance (NMR) 1D ( H and C), 2D NMR ( H- 1 H COSY, HMQC and HMBC), mass spectrometry and optical. The antioxidant capacity was determined by DPPH assay, to evaluate the IC50 (µg/mL). The wound healing activity was assessed at 4, 7, 12 and 17 days of treatment with a gel containing 1% of CE across the length and thickness of the re-epithelialized area, analysis of skin permeation by photoacoustic spectroscopy, number of cells and fibers in metaphase collagen (types I and III). From column chromatography 21 subfractions were obtained. Subfractions F4, F5, F6 and F7 were chromatographed on HSCCC for separation of compounds. The compounds 4′- O-methyl-gallocatechin, gallocatechin, epigallocatechin and 4′-O-methyl-gallocatechin- (4α→8)-4′-O-methyl-gallocatechin were identified. The antioxidant capacity of the samples were: CE=3.99, EAF=3.47, AF=5.19 and vitamin C = 5.19, and the CE and the EAF have an antioxidant capacity about 1.3 and 1.5 times greater than vitamin C, respectively. The evaluation of wound healing activity showed the formation of a re-epithelialized area greater in animals treated with CE at 4 and 7 days and thicker at 17 days, as the proliferation of metaphases after 4 and 17 days. The stimulation of maturation of collagen fibers (type I) at 17 days of treatment was highest in treatment with the gel containing 1% CE. In assessing the wound healing activity, proved the permeation of EB in all periods analyzed and the gel containing EB showed activity on the tissue repair, providing more rapid and strong healing at 17 days of treatment with regard to control. The analysis by Western Blotting confirms the presence of larger blood vessels at 7 days in large quantities by the expression of VEGEFR.
Keywords: Stryphnodendron adstringens, Wound healing, Diabetes mellitus, Condensed tannins, Antioxidant capacity in vitro, VEGFR.
Dissertação PDF: Sandra Cristina Girotto Pinto
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